關鍵詞:454(GS FLX系統)超高通量測序|實驗技術服務
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454(GS FLX系統)超高通量測序|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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產品品牌：454(GS FLX系統)超高通量測序|實驗技術服務   http://www.shijichina.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
實驗描述               
GS FLX系統的工作流程
GS FLX系統的流程概括起來，就是“一個片段 = 一個磁珠 = 一條讀長（One fragment = One bead = One read）”。
1）樣品輸入并片段化：GS FLX系統支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800 bp的片段；對于小分子的非編碼RNA或者PCR擴增產物，這一步則不需要。
2）文庫制備：借助一系列標準的分子生物學技術，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA段上。接頭也將用于后續的純化，擴增和測序步驟。變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA），具有A、B接頭的單鏈DNA段組成了樣品文庫。
3）一個DNA段＝一個磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設計的DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA段。磁珠結合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應器。
4）乳液PCR擴增：每個獨特的片段在自己的微反應器里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。對于每一個片段而言，擴增后產生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增的片段仍然結合在磁珠上。
5）一個磁珠＝一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入“Pico TiterPlate”（PTP）板中進行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序開始。放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經過一個合成反應和一個化學發光反應，*終將螢光素氧化成氧化螢光素，同時釋放出光信號。此反應釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD相機捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。這也就是大名鼎鼎的焦磷酸測序。
6）數據分析：GS FLX系統在10小時的運行當中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息。GS FLX 系統提供兩種不同的生物信息學工具對測序數據進行分析，適用于不同的應用：達400 MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。
GS FLX系統的準確率在99%以上。其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續摻入，如AAA或GGG。由于沒有終止元件來阻止單個循環的連續摻入，同聚物的長度就需要從信號強度中推斷出來。這個過程就可能產生誤差。因此，454測序平臺的主要錯誤類型是插入-缺失，而不是替換。