關鍵詞:DNA測序服務|實驗技術服務
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DNA測序服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
DNA測序技術，即測定DNA序列的技術。在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger等(1977)發明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert(1977)發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生 A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前 Sanger測序法得到了廣泛的應用。
該成果實現了與國際主流設備性能相當的國產化DNA測序能力，在基因組學、生物信息學，乃至生命科學諸多方向的基礎研究和應用研究方面具有重要實用價值。
1. 對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。
2. 對于每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑:
(1) 樣品反應:
質粒模板DNA 2.1pmol
5×測序緩沖液 5ml
引物 4.5pmol
無菌ddH2O 至終體積16ml
(2)對照反應
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml
5×測序緩沖液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
無菌ddH2 O 至終體積 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇*佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。
7. 熱循環程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
[注意] 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入:
模板種類/長度 模板量
200bp (PCR產物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp(超螺旋質粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)
由于超螺旋質粒產生的信號比松弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式:
4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數
計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式:
dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基對數
ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基數
3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1:適用于引物<24堿基或GC含量<50%
95℃ 2分鐘。然后: 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鐘(延伸)
模式2:適用于≥24堿基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鐘, 然后: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。