關鍵詞:IP和Co-IP|實驗技術服務
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IP和Co-IP|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：（1）測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；（2）確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔；（3）分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。
其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的proreinA就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。
實驗材料 蛋白質、試劑、試劑盒 RIPA BufferPBSProtein A agarose瓊脂糖考馬斯亮藍染色液
儀器、耗材 離心機搖床EP管細胞刮子離心管培養板電泳儀電泳槽高效液相色譜儀
試劑準備 
1.  預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機。
2.  用預冷的PBS洗滌細胞兩次，*后一次吸干PBS。
3.  加入預冷的RIPA Buffer(1 ml/107個細胞、10 cm培養皿或150 cm2培養瓶，0.5 ml/5×106個細胞、6 cm培養皿、75 cm2培養瓶）。
4.  用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。
5.  4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉移到一個新的離心管中。
6.  準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。
7.   每1 ml總蛋白中加入100 μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。
8.   4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子。
9． （Bradford 法）做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）。
10.  用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl）。
11.  加入一定體積的兔抗到500 μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異。
12.  4℃緩慢搖動抗原抗體混合物室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。
13.  加入100 μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。
14.  14000 rpm瞬時離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS。
15.  用60 μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）。
16.  將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮5 min變性。
免疫共沉淀反應 
1． 轉染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min,細胞裂解液于4°C，*大轉速離心30 min后取上清；
2． 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育；
3． 取10 μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min；
4. 將預處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；
5． 免疫沉淀反應后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3－4次；*后加入15 μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；
6． SDS-PAGE，Western blotting或質譜儀分析。
通過免疫共沉淀確定結合蛋白 
1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中；
2．將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以*大速度離心15 ；
3．收集上清（約30 ml）并加入30 μg的適當抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h；
4．加入0.9 ml的蛋白質A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min；
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復洗5次。*后，用NETN洗一次；
6．吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min
7．將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳；
8．通過考馬斯亮藍染色觀察蛋白質泳帶；
9．從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1 ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min；
10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質，再將肽電洗脫；
11． 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。