關鍵詞:基因克隆與定點突變服務|實驗技術服務
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基因克隆與定點突變服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數據真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒，客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
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測序實驗流程：
定點突變是指通過聚合酶鏈式反應(PCR)等方法向目的DNA段(可以是基因組，也可以是質粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化)，包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。
定點突變的比較有特色的產品還有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根據準備突變的質粒自行設計兩條引物(同一方向，對同一單鏈模版)，一條包含計劃定點突變的序列，另一條引物包含質粒上某一個單酶切位點，不過在單酶切位點中引入突變，這樣兩條引物除了所包含的突變位點，其他序列和質粒上對應位置的序列完全一致，退火后和質粒模版結合，通過T4 DNA聚合酶延伸，延伸反應持續直到碰到另一條引物停止，兩段包含突變位點的延伸產物經T4連接成環，和模版鏈組成雜和環，帶有兩處錯配。單酶切反應產物，直接轉化Ecoli BMH 71-18 mutS(錯配修復缺陷株)。原來的雙鏈質粒模版被切開而不能轉化，而雜和質粒由于一條鏈上單酶切位點引入突變而不被切開，保持環狀質粒得以轉化。轉化子的雜和雙鏈在E.coli的復制過程中分開，再經過一輪提質粒、單酶切、轉化，*后得到純和的突變質粒。這個試劑盒則是利用改造單酶切位點使得新合成的突變質粒不被切開從而除去原來的模版質粒。
有的時候研究可能需要多個位點的定點突變，比如改造酶的活性或者動力學特性，研究蛋白之間的相互作用位點等，單點突變不能滿足實驗的需要，重復進行單點突變也非常浪費時間。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。*多一次實驗可以引入5個定點突變。這個試劑盒的原理和Clontech的相似，就是準備多個帶突變的引物(同方向，對同一單鏈模版)，退火后全部突變引物(不超過5個)都結合在同一環狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個引物就停止，各片斷經連接成環，和單鏈模版組成雜和環，DpnI消化雙鏈模版，也消化雜和環中的模版，只留下新合成的帶多個突變的單鏈環(mutant ssDNA)，得以轉化E.coli，形成雙鏈質粒。資料表明，引入3個定點突變的效率為60%，5個定點突變的效率為30%。得到的其他質粒是帶有較少定點突變的質粒，以引入3個定點突變為例，就是有40% 左右的轉化質粒是帶有1-2個不同定點突變的質粒(因為存在1-2個引物結合模版延伸形成單鏈環的可能)。
流程
定點突變一般須有含有待突變基因的高純度質粒，不少于10μg，電泳圖清晰，達酶切及測序要求;
1.對待突變基因測序結果進行分析，設計突變方案;
2.根據突變方案設計合成覆蓋突變位點的雙向引物，合成目的DNA兩端引物，進行高保真PCR反應;
3.默認情況下，將PCR產物克隆至T載，或者根據要求亞克隆至目的載體;DNA測序驗證突變序列的正確性。
定點突變適用于蛋白結構已有初步了解的基因，比PCR隨機突變更有目的性，也更為**，簡單，同時改造基因更加"隨心所欲"。由于定點突變技術在蛋白質組學中有這非常廣泛的應用前景，相信這個技術在不遠的將來還會有更大的改進和發展，也必將為更多人熟悉應用。