關鍵詞:實時熒光定量PCR(RealTime PCR)服務|實驗技術服務
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實時熒光定量PCR(RealTime PCR)服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數據真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質粒，客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
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測序實驗流程：
1 收集樣品
2 相關試劑 總RNA提取試劑TREzol Reagent (RNA提取試劑), M-MLV(cDNA逆轉錄酶), RNA 純化試劑, RealqPCR MasterMix (熒光定量PCR預混試劑)。
3 實驗儀器 熒光定量PCR儀; PCR儀;低溫離心機。
4 總RNA提取
5 cDNA合成 在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl); 2µl隨機引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl體系。混勻后70℃變性RNA 5分鐘，冰上速冷1分鐘，離心將溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl體系。PCR儀中反應條件設置 37℃延伸60min，70℃保溫15min終止反應。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存備用。
6 引物設計與thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成
7 實時定量PCR 按以下反應體系進行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR儀擴增反應條件設置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40個循環)。
8 PCR產物溶解曲線分析 將所擴增的PCR 產物進行溶解曲線分析，單峰溶解曲線表示擴增產物單一，無非特異性擴增產物。溶解曲線生成的反應程序為: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。
9 數據分析軟件對數據進行處理分析。
實時熒光定量PCR技術的主要應用
1. DNA 或RNA 的**定量分析:包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等;
2. 基因表達差異分析:例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結果的確證;
3. 基因分型:例如SNP 檢測，甲基化檢測等。
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
此方法適用于:
1、靈敏度高:使用SYBR可使熒光效果增強到1000倍以上
2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。
3、通用型方法，在國內外科研中普遍使用。
4、高通量大規模的定量PCR檢測
5、專一性要求不高的定量PCR檢測。