關鍵詞:Southern Blot技術服務|實驗技術服務
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Southern Blot技術服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
一、 待測核酸樣品的制備
(一)制備待測DNA
基因組DNA是從動物組織(或)細胞制備。1.采用適當的化學試劑裂解細胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細胞;2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質和RNA;3.用有機試劑(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白質。
(二) DNA限制酶消化
基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據不同目的設定，有時可采用部分和充分消化相結合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進行電泳分離。
預雜交(prehybridizafion)
(一) 配制預雜交液:6XSSC，5XDenhardt's試劑，0.5%SDS，50%(v/v)甲酰胺，ddH2O，100ug/ml鮭魚精DNA變性后加入。注:1.每平方硝酸纖維素膜需預雜交液0.2ml。2.預雜交液制備時可用或不用poly(A)RNA。3.當使用32P標記的cDNA作探針時，可以在預雜交液或雜交液中加入poly(A)RNA以避免探針同真核生物DNA中普遍存在的富含胸腺嘧啶的序列結合。4.按照探針、靶基因和雜交液的特性確定合適的雜交溫度(Thyb)。(如果使用標準雜交液，靶序列DNA GC含量為40%，則Thyb為42℃。)
(二)把預雜交液放在滅菌的塑料瓶中，在水浴中預熱至雜交溫度。
(三)將表面帶有目的DNA的硝酸纖維素濾膜放入一個稍寬于濾膜的塑料袋，用5-10ml2×SSC浸濕濾膜。
(四)將鮭魚精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
(五)從塑料袋中除凈2×SSC，加入預雜交液，按每平方濾膜加0.2ml。
(六)加入變性的鮭魚精DNA置終濃度200μg/ml。
(七)盡可能除凈袋中的空氣，用熱封口器封住袋口，上下顛倒數次以使其混勻，置于42℃水浴中溫育4h.
Southern雜交
(一)原理
轉印后的濾膜在預雜交液中溫育4-6h，即可加入標記的探針DNA(探針DNA預先經加熱變性成為單鏈DNA分子)，即可進行雜交反應。雜交是在相對高離子強度的緩沖鹽溶液中進行。雜交然后在較高溫度下用鹽溶液洗膜。離子強度越低，溫度越高，雜交的嚴格程度越高，也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時，才能在低鹽高溫的雜交條件下結合。
(二) 步驟
1.將標記的DNA探針置沸水浴10min，迅速置冰上冷卻1-2min，使DNA變性。
2.從水浴中取出含有濾膜和預雜交液的塑料袋，剪開一角，將變性的DNA探針加到預雜交液中。
3.盡可能除取袋中的空氣，封住袋口，滯留在袋中的氣泡要盡可能地少，為避免同位素污染水浴，將封好的雜交袋再封入另一個未污染的塑料袋內。
4.置42℃水浴溫育(至少18h)。
結果注意:
在膜上陽性反應呈帶狀。實驗中應注意以下問題:轉膜必需充分，要保證DNA已轉到膜上。雜交條件及漂洗是保證陽性結果和背景反差對比好的關鍵。洗膜不充分會導致背景太深，洗膜過度又可能導致假陰性。若用到有毒物質，必需注意**及**。
主要應用:
1.遺傳病診斷
2.DNA圖譜分析
3.檢測樣品中的DNA及其含量
4.PCR產物分析